СТРОЕНИЕ И ФУНКЦИИ ОРГАНИЗМА ЧЕЛОВЕКА
генетика, строение клетки

Новости

Дифференциальное центрифугирование позволяет разделить клетки на фракции

Мы как раз начали применять еще новый в то время метод дифференциального центрифугирования. Он сводится к тому, что клетки разрушают в гомогенизаторе, а затем центрифугируют при последовательно возрастающих скоростях, после чего получают несколько фракций, состоящих из разных органелл (рис. 1.) Выделенные таким путем органеллы все еще сохраняют многие из своих функциональных свойств, которые можно затем изучить посредством биохимических методов. Наша задача состояла в том, чтобы установить местонахождение в этих фракциях некоторых ферментов, участвующих в обмене углеводов в печени крысы, и тем самым выяснить, с какими клеточными структурами связаны эти ферменты. Как правило, мы проверяли сначала гомогенат клеток на присутствие данного фермента, а затем искали его во фракциях. Среди прочих ферментов мы работали с так называемой кислой фосфатазой. Этот фермент, отщепляющий неорганический фосфат от ряда фосфорных эфиров, не связан непосредственно с углеводным обменом. В основном он служил нам в качестве контроля.

К нашему удивлению, активность кислой фосфатазы в гомогенате была в 10 раз меньше той величины, которую следовало ожидать на основании предыдущих анализов препаратов, подвергнутых более основательному разрушению в смесителе Уоринга. Суммарная активность всех фракций хотя и превышала вдвое активность гомогената, но все-таки была в 5 раз меньше ожидаемой величины. Когда через пять дней мы повторили определения на тех же фракциях (которые хранили все время в холодильнике), то оказалось, что активность фермента значительно возросла во всех отдельных фракциях, а особенно во фракции, содержащей митохондрии. Теперь суммарная активность уже достигла ожидаемой величины.

К счастью, мы устояли перед искушением отбросить первую серию данных как результат технической ошибки. Мы провели несколько дополнительных опытов и быстро получили ключ к разгадке тайны. В живых клетках фермент в основном (или даже полностью) заключен внутри небольших мешочкоподобных частиц. Поверхностная мембрана этихчастиц не только способна удерживать фермент внутри частицы, но и препятствует проникновению извне тех мелких молекул фосфорных эфиров, с которыми мы работали. Активность, измеренная в наших опытах, характеризовала лишь ту небольшую часть фермента, которая либо находилась в клетке в свободном состоянии, либо освободилась из частиц, поврежденных в ходе опыта. Смеситель Уоринга практически разрушает все частицы; при более мягкой обработке в гомогенизаторе, которую мы применили в наших исследованиях, разрушается лишь около 10% частиц. Этим и объясняется низкая первоначальная активность фермента в гомогенате. Дальнейшее фракционирование приводит к возрастанию суммарной активности во фракциях еще на 10%. Остальная часть фермента освобождается в результате старения частиц при хранении их в течение пяти дней в холодильнике.

TBegin-->Дифференциальное центрифугирование позволяет разделить клетки на фракцииTEnd-->

Рис. 1. Дифференциальное центрифугирование позволяет разделить клетки на фракции, состоящие из различных клеточных компонентов. Быстрое механическое вращение пестика разрушает клетки, вызывая освобождение их содержимого в окружающую среду. Гомогенат подвергается последовательному центрифугированию при разных скоростях. Метод, разработанный В. Шнайдером, включает этапы 1—8. Автор и его сотрудники ввели этапы 9 и 10. Фракция митохондрий (6 этап) осаждается после центрифугирования при 25 000 g в течение 10 мин. Числа, характеризующие градиент плотности сахарозы, показывают удельный вес (г/см3).

Разработка web-studio, ©-2012.
при использовании материалов с сайта гиперссылка на источник обязательна.
Яндекс.Метрика