СТРОЕНИЕ И ФУНКЦИИ ОРГАНИЗМА ЧЕЛОВЕКА
генетика, строение клетки

Новости

Метод центрифугирования в сахарозном градиенте

В качестве основного метода мы применяли в нашей работе центрифугирование в градиенте плотности сахарозы; этот метод позволяет разделять материалы, осаждающиеся с разными скоростями в сильном гравитационном поле. Метод заключается в следующем (рис. 2). Пластмассовую центрифужную пробирку наполняют раствором сахара, концентрация которого плавно меняется от 30% на дне пробирки до 15% в верхнем слое. Для получения градиента достаточно медленно наполнять пробирку из двух сосудов, содержащих 15 и 30% раствора сахарозы. Испытуемый материал, состоящий из молекул различной величины, осторожно наслаивают поверх раствора сахара, после чего помещают пробирку в центрифугу с бакет-ротором. Сахарозный градиент сохраняется во время центрифугирования и после него за счет силы тяжести. Во время центрифугирования молекулы, осаждающиеся с различными скоростями, проходят неодинаковое расстояние и остаются разделенными и после центрифугирования. Дно пробирки прокалывают и собирают на коллекторе отдельные фракции. Теперь можно различными путями анализировать эти фракции.

Мы поставили такой простой опыт. Суспензию ретикулоцитов кролика инкубировали в питательной среде, а затем выдерживали в течение 45 сек с аминокислотами, содержащими радиоактивный изотоп углерода С14. Мы намеренно брали такой короткий промежуток времени, так как нас интересовали ранние этапы белкового синтеза. Через 45 сек мы охлаждали клетки, чтобы прекратить дальнейший обмен веществ, осторожно разрушали их и помещали в пробирку с сахарозным градиентом. По окончании центрифугирования фракции, собранные на коллекторе, подвергали анализу. Прежде всего мы измеряли оптическую плотность, или поглощение в ультрафиолетовой области спектра при длине волны 2 600 ангстремов, для определения нуклеиновых кислот. Поскольку в рибосомах содержится большое количество рибонуклеиновой кислоты, этот чувствительный метод позволяет обнаружить их присутствие. Кроме того, мы измерили радиоактивность различных фракций. Подобное измерение указывало на наличие аминокислот, содержащих С14; следовательно, мы могли узнать, в каких фракцияхсодержались полипептидные цепи, продолжавшие paсти.

Полученные результаты приведены на рис. 3. На кривой поглощения и ультрафиолете видны два пика, которые соответствуют фракциям из верхнего слоя пробирки. Первый пик типичен для отдельных рибосом, имеющих константу седиментации 74. Второй пик гораздо шире; константа седиментации соответствующей фракции в 2,5 раза выше. Далее, пик радиоактивности связан со вторым пиком, а не с пиком отдельных рибосом. Следовательно, именно второй пик на графике соответствует фракции, и которой идет белковый синтез.

TBegin:http://enetil.kg/uploads/posts/2012-11/1354250915_00-2.jpg|-->Метод центрифугирования в сахарозном градиентеTEnd-->

Pис. 2. Метод центрифугирования в сахарозном градиенте представляет собой простой способ разделения клеточных компонентов. Сначала в пробирке создают градиент концентраций (1). В типичном опыте ретикулоциты кролика инкубируют в течение 45 секунд с аминокислотами, меченными радиоактивным углеродом С14. Рибосомы наносят слоем поверх сахарного градиента (2) и помещают пробирку в центрифугу (3). Разделенные фракции последовательно собирают (5) и анализируют. Рибосомы можно обнаружить по характерной интенсивной полосе поглощения в ультрафиолетовой области при 2600 ангстремах (6). На счетчике определяют присутствие вновь синтезированных полипептидных цепей, содержащих С14 (7). Эти цепи оказываются в наиболее быстро осаждающихся фракциях.

TBegin:http://enetil.kg/uploads/posts/2012-11/1354250914_00-3.jpg|-->Метод центрифугирования в сахарозном градиентеTEnd-->

Рис. 3. Обычное распределение рибосом из ретикулоцитов кролика; быстро осаждающаяся фракция содержит полирибосомы, медленно осаждающаяся фракция — отдельные рибосомы. Расположение пика радиоактивности (кривая радиоактивности — черные кружки) указывает на то, что вновь синтезированные полипептиды содержатся в полирибосомах.

Разработка web-studio, ©-2012.
при использовании материалов с сайта гиперссылка на источник обязательна.
Яндекс.Метрика